Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный




НазваниеУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
страница2/4
Дата конвертации01.03.2016
Размер0.69 Mb.
ТипДокументы
1   2   3   4

3. Основные материалы, оборудование, питательные среды


Автоклав (паровой стерилизатор)                      ГОСТ 19569


Вытяжной шкаф


Ламинарный шкаф для культуры клеток (класс I)


Ламинарный шкаф (класс II)


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


Инвертированный микроскоп


Весы лабораторные 2-го класса точности


с наибольшим пределом взвешивания 200 г              ГОСТ 24104


рН-метр любой марки с набором электродов


с погрешностью измерений +/- 0,1


Термометры, 0 - 100 °С, цена деления 1 °С            ГОСТ 28498


Дистиллятор электрический ДЭ-4


Термостаты электрические суховоздушные


с автоматическим терморегулятором до 50 °С,


поддерживающие заданную температуру


с погрешностью +/- 1 °С


Центрифуга лабораторная рефрижераторная,


например, типа ЦЛР-1МР                               ТУ 42-2145


Ультрацентрифуга


Встряхиватель


Холодильники бытовые электрические с


температурой в камере 4 - 6 °С


Холодильники бытовые электрические


низкотемпературные с температурой в камере -20 °С


Морозильник с температурой в камере -70 °С


Магнитная мешалка


Аппарат фильтрационный, например, марки АФ-142 "Н"


или марки АФ-142 "К"


Макропористое стекло, например, марки МПС 1000 ВГХ


Набор для концентрирования с помощью пакетов


с адсорбентом


Ионообменная смола (Анионит АВ-17-8; АВ-17-8-чс)     ГОСТ 20301-74


Набор для сбора и концентрирования вирусов


из питьевой воды в системе децентрализованного


хозяйственно-питьевого водоснабжения,


поверхностных и сточных вод


Флизелиновая ткань


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


Мембрана микропористая капроновая (ММК - диаметр


пор 0,2 мкм)


Мембрана для концентрирования вирусов из воды


типа ФМНЦ - 0,2 мкм или ФМПА - 0,2 мкм


Стерилизующие насадки с фильтрами 0,22 мкм для


стерилизации элюатов


Бутыли Вульфа на 10 л


Канистры полиэтиленовые на 5 и 10 л


Воронки конические делительные ВД-1 - 1000 мл


Колбы плоскодонные конические разной вместимости     ГОСТ 25336


Пипетки разной вместимости 2 класса точности         ГОСТ 20292


Пробирки типов П1 и П2                               ГОСТ 25336


Штативы для пробирок


Штативы химические


Цилиндры на 100 - 250 куб. см                        ГОСТ 1770


Чашки Петри диаметром 90 - 100 мм                    ГОСТ 25336


Посуда для культур клеток - стерильные


культуральные флаконы, планшеты, пробирки,


пипетки и пр.


Твердотельный термостат для пробирок на


25 - 100 °С, например, типа "эппендорф"


Вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой


Микроцентрифуга для пробирок до 16000 g,


например, типа "эппендорф"


Центрифуга-вортекс


Амплификатор


ПЦР-бокс с бактерицидной лампой


Камера для горизонтального электрофореза


Ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом


для просмотра гелей


Одноразовые пробирки объемом 1,5; 0,5; 0,2 мл,


например, типа "эппендорф"


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


Автоматические пипетки объемом от 0,5 мкл до 1 мл


Сменные одноразовые наконечники с аэрозольными


фильтрами и без


Иммуноферментный анализатор


Прибор для промывки плашек


Шейкер-термостат


Автоматические пипетки-дозаторы различных объемов


Биф-экстракт (мясной экстракт)


Декстран Т40 ПЭГ 6000


Вода дистиллированная                                ГОСТ 6709


Калий фосфорнокислый однозамещенный, ч.д.а.


Калий фосфорнокислый двузамещенный, ч.д.а.


Магний хлористый кристаллический, ч.д.а.


Натрий фосфорнокислый двузамещенный, ч.д.а.


Натрий хлористый                                     ГОСТ 3118


Спирт этиловый ректификационный                      ГОСТ 5962


Перекись водорода 33%


Хлороформ                                            ГОСТ 22300


Фосфатно-солевой твинсодержащий буфер (рН 7,2)


Раствор Версена


Раствор трипсина 0,25%


Среда 199 на растворе Хенкса


Среда Игла, рН 7,2


Среда Игла MEM, рН 7,2 с двойным набором аминокислот


Стерильная эмбриональная сыворотка КРС


Бензилпенициллат натрия


Сульфат стрептомицина


Перевиваемые линии клеток RD, НЕР-2, BGM, L20B


Набор диагностических сывороток для типирования


полио- и энтеровирусов


Набор для выделения РНК, например, типа


"Рибозоль", "Амплисенс" и др.


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


5х или 10х буфер для обратной транскрипции


Обратная транскриптаза (вируса птичьего


миелобластоза или вируса лейкемии, мышей Молони),


например, типа "Амплисенс" и др.


Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (ДНТФ),


например, типа "Амплисенс" и др.


Ингибитор РНКаз


Олигонуклеотиды (прямой праймер не менее 3 ОЕ/мл)


Свободная от РНКаз вода


Тест-система для определения РНК энтеровирусов


Тест-система для определения РНК вируса гепатита А


Тест-система для определения РНК ротавирусов


Тест-система для определения антигена вируса


гепатита А


Тест-система для определения антигенов ротавирусов


Примечание. Могут использоваться материалы, оборудование, питательные среды, тест-

системы с аналогичными характеристиками, разрешенные к применению для этих целей в

Российской Федерации в установленном законодательством порядке.


4. Общие правила отбора проб из различных водных объектов


Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую

посуду или стерильные емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не

оказывающих инактивирующего действия на вирусы. Емкости должны быть оснащены плотно

закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми или из других материалов) и защитным

колпачком (из алюминиевой фольги, плотной бумаги). Емкость открывают непосредственно перед

отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости не

должны чего-либо касаться. Ополаскивать посуду не допускается. При исследовании воды из

распределительных сетей отбор проб из крана производят после его предварительной стерилизации

обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 мин. при полностью открытом кране. При

отборе пробы напор воды может быть уменьшен. Пробу отбирают непосредственно из крана без

резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок. Если через пробоотборный кран

вода течет постоянно, отбор проб производят без предварительного обжига, не изменяя напора воды

и существующей конструкции (при наличии силиконовых или резиновых шлангов).


Если отбирают пробу после обеззараживания химическими реагентами, то для нейтрализации

остаточного количества хлорсодержащих дезинфектантов в емкость, предназначенную для отбора

проб, вносят до стерилизации натрий серноватистокислый в виде кристаллов или

концентрированного раствора из расчета 10 мг на 500 мл воды. После наполнения емкость


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


закрывают стерильной пробкой и колпачком. При отборе проб в одной и той же точке для различных

целей, первыми отбирают пробы для бактериологических исследований.


Отобранную пробу маркируют и сопровождают актом отбора проб воды с указанием места,

даты, времени отбора и другой необходимой информации.


К исследованию проб воды необходимо приступить сразу же после доставки проб в

лабораторию.


5. Методы концентрирования вирусов из воды


различного назначения


В данном разделе представлены современные методы концентрирования вирусов из воды,

предназначенные для качественной или количественной оценки вирусного загрязнения. Перечень

методов и область применения представлены в табл. 1.


Таблица 1


ОБЪЕМ ПРОБ, УСЛОВИЯ И ПЕРИОДИЧНОСТЬ ОТБОРА ПРОБ ВОДЫ ВОДНЫХ


ОБЪЕКТОВ НА ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ


----T-----------T------------------------------------T-----------¬


¦ N ¦ Вид водного ¦ Объем исследуемой воды, показания к ¦ Методы     ¦


¦ п/п ¦   объекта  ¦ проведению и кратность анализа при ¦ концентри- ¦


¦    ¦            ¦               контроле:             ¦ рования    ¦


¦    ¦            +--------T---------T---------T-------+            ¦


¦    ¦            ¦ плановом ¦ внеплано- ¦ внеплано- ¦ произ- ¦            ¦


¦    ¦            ¦         ¦ вом - по ¦ вом - по ¦ водст- ¦            ¦


¦    ¦            ¦         ¦ экстрен- ¦ санитар- ¦ венном ¦            ¦


¦    ¦            ¦         ¦ ным пока- ¦ но-эпиде- ¦ - в со- ¦            ¦


¦    ¦            ¦         ¦ заниям   ¦ мическим ¦ ответ- ¦            ¦


¦    ¦            ¦         ¦          ¦ показани- ¦ ствии с ¦            ¦


¦    ¦            ¦         ¦          ¦ ям, по   ¦ рабочей ¦            ¦


¦    ¦            ¦         ¦          ¦ согласо- ¦ про-   ¦            ¦


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


¦    ¦            ¦         ¦          ¦ ванию с  ¦ граммой ¦            ¦


¦    ¦            ¦         ¦          ¦ ТУ Рос-  ¦        ¦            ¦


¦    ¦            ¦         ¦          ¦ потреб-  ¦        ¦            ¦


¦    ¦            ¦         ¦          ¦ надзора  ¦        ¦            ¦


+---+-----------+--------+---------+---------+-------+-----------+


¦ 1  ¦ Чистая     ¦         ¦          ¦          ¦        ¦            ¦


¦    ¦ вода:      ¦         ¦          ¦          ¦        ¦            ¦


¦    ¦ а) питьевая ¦ 10 л -  ¦ 10 - 50 л ¦ 10 и     ¦ 10 -   ¦ Ионообмен- ¦


¦    ¦            ¦ 1 раз в ¦          ¦ 1000 л   ¦ 50 л   ¦ ная смола. ¦


¦    ¦            ¦ квартал ¦          ¦          ¦        ¦ Мембранная ¦


¦    +-----------+--------+---------+---------+-------+ фильтрация. ¦


¦    ¦ б) подзем- ¦ 10 л - 1 ¦ 10 - 50 л ¦ 10 и     ¦ 10 -   ¦ Двухэтапный ¦


¦    ¦ ных источ- ¦ раз в   ¦          ¦ 1000 л   ¦ 50 л   ¦ метод.     ¦


¦    ¦ ников      ¦ квартал ¦          ¦          ¦        ¦ Ловушечное ¦


¦    +-----------+--------+---------+---------+-------+ устройство ¦


¦    ¦ в) плава-  ¦ по со-  ¦ 10 - 50 л ¦ 10 и     ¦ 10 -   ¦            ¦


¦    ¦ тельных    ¦ гласова- ¦          ¦ 1000 л   ¦ 50 л   ¦            ¦


¦    ¦ бассейнов  ¦ нию с ТУ ¦          ¦          ¦        ¦            ¦


¦    ¦            ¦ Роспот- ¦          ¦          ¦        ¦            ¦


¦    ¦            ¦ ребнад- ¦          ¦          ¦        ¦            ¦


¦    ¦            ¦ зора    ¦          ¦          ¦        ¦            ¦


+---+-----------+--------+---------+---------+-------+-----------+


¦ 2  ¦ Вода по-   ¦         ¦          ¦          ¦        ¦ Адсорбцион- ¦


¦    ¦ верхностных ¦         ¦          ¦          ¦        ¦ ный метод  ¦


¦    ¦ водоемов:  ¦         ¦          ¦          ¦        ¦ (МПС).     ¦


¦    ¦ а) источник ¦ 10 л -  ¦ 10 л     ¦ 10 л     ¦ 10 л   ¦ Ионообмен- ¦


¦    ¦ водоснабже- ¦ 1 раз в ¦          ¦          ¦        ¦ ная смола. ¦


¦    ¦ ния        ¦ квартал ¦          ¦          ¦        ¦ Мембранная ¦


¦    +-----------+--------+---------+---------+-------+ фильтрация. ¦


¦    ¦ б) рекреа- ¦ 1 раз   ¦          ¦          ¦        ¦ Двухэтапный ¦


¦    ¦ ционные    ¦ в месяц ¦          ¦          ¦        ¦ метод      ¦


¦    ¦ воды       ¦ с мая   ¦          ¦          ¦        ¦            ¦


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


¦    ¦            ¦ по сен- ¦          ¦          ¦        ¦            ¦


¦    ¦            ¦ тябрь   ¦          ¦          ¦        ¦            ¦


+---+-----------+--------+---------+---------+-------+-----------+


¦ 3  ¦ Сточные    ¦ 1 л -   ¦ 1 - 5 л  ¦ 1 - 5 л  ¦ 1 - 5 л ¦ Двухфазный ¦


¦    ¦ воды после ¦ 1 раз в ¦          ¦          ¦        ¦ метод.     ¦


¦    ¦ очистки и  ¦ месяц в ¦          ¦          ¦        ¦ Адсорбцион- ¦


¦    ¦ обеззара-  ¦ конт-   ¦          ¦          ¦        ¦ ный метод  ¦


¦    ¦ живания    ¦ рольном ¦          ¦          ¦        ¦ (МПС).     ¦


¦    ¦            ¦ створе  ¦          ¦          ¦        ¦ Ионообмен- ¦


¦    ¦            ¦         ¦          ¦          ¦        ¦ ная смола  ¦


L---+-----------+--------+---------+---------+-------+------------


Выбор того или иного метода в практике контроля вирусного загрязнения определяют

эпидемической ситуацией в регионе, задачами региональных планов по снижению заболеваемости

кишечными вирусными инфекциями, уровнем оснащенности лабораторий.


Все работы, связанные с концентрированием и выделением вирусов, проводят с соблюдением

правил эпидемиологической безопасности, в соответствии с нормативными документами:

санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с

микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)", санитарными правилами СП 1.2.731-99

"Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".


5.1. Метод концентрирования вирусов с использованием фильтрующих мембран


5.1.1. Область применения.


Метод используют для концентрирования вирусов из питьевой воды различных видов

(водопроводной, бутылированной, из родников и др.), воды подземных водоисточников, воды из

бассейнов и других чистых вод. Объем исследуемой воды составляет 10 л. При необходимости объем

воды может быть увеличен. Время концентрирования данным методом из 10 л составляет в среднем

1,5 - 2,5 ч. Для концентрирования используют фильтрующие мембраны из нитроцеллюлозы типа

ФМНЦ, ФМПА и мембраны микропористые капроновые (ММК) или другие, равные по

эффективности.


5.1.2. Подготовка мембранных фильтров.


Фильтрующие мембраны должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями

организации-изготовителя (листовка-аннотация, сопровождающая фильтры). Перед исследованием

фильтрующие мембраны смачивают стерильной водопроводной водой в стерильной емкости.


5.1.3. Подготовка фильтровального аппарата.


Для фильтрования исследуемой воды используют установку, например, типа АФ-142 "К" или

другую с аналогичными характеристиками, которая состоит из фильтродержателя, емкости на 10 и


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


более литров для исследуемой воды и ее последующей фильтрации и устройства, нагнетающего

жидкость.


Перед фильтрацией фильтродержатель протирают ватным тампоном, смоченным спиртом

ректификованным 70%, и обжигают. После охлаждения на нижнюю часть фильтродержателя кладут

стерильным пинцетом влажный мембранный фильтр, предварительно смоченный в стерильной

водопроводной воде. Затем фильтр прижимают верхней частью фильтродержателя и закрепляют

зажимами, равномерно завинчивая последние со всех сторон.


5.1.4. Фильтрование воды.


Исследуемый объем воды наливают в напорную емкость, крышку тщательно закрепляют

зажимами, включают подачу давления (1,5 - 2,0 бара), после чего воду направляют в

фильтродержатель со скоростью около 100 мл/мин. и фильтруют через мембрану. При использовании

для концентрирования мембран, например, типа ФМНЦ, в исследуемую воду добавляют хлористый

магний до конечной концентрации 0,05 М или хлористый алюминий до конечной концентрации

0,0005 М для увеличения сорбционной способности мембраны. При использовании фильтров ММК

хлористый магний не добавляют.


5.1.5. Элюция сконцентрированных вирусных частиц.


Элюцию вирусов с мембран проводят 20 мл элюента с соблюдением всех правил

эпидемической безопасности (перчатки, маска, спецодежда и т.д.) в ламинарном боксе. После

окончания фильтрования откручивают зажимы и снимают верхнюю часть фильтродержателя.

Мембрану осторожно приподнимают за край пинцетом, стерилизованным путем обжигания и

переносят в стерильную емкость, соответствующую диаметру мембраны (может быть использована

тарелка, чашка Петри диаметром не менее 142 мм и др.). Затем на поверхность мембраны наносят 10

мл элюента (3% бифэкстракт на трисбуфере с рН 9,1 - 9,5) и стерильной пипеткой с целым концом

проводят механический смыв (соскабливанием и струей) вируса с поверхности мембраны в течение

нескольких минут. К концу манипуляции мембрана должна приобрести первоначальный вид.

Полученный элюат переносят в стерильный флакон. Затем на эту же мембрану наносят второй объем

(10 мл) того же элюента и проводят вторичное смывание вирусов струей с обеих сторон мембраны, и

вторую часть элюата помещают в тот же флакон, что и первую. Затем рН полученного элюата

доводят до 7,0 - 7,5 1 N раствором соляной кислоты.


5.1.6. Обработка проб.


Для удаления бактериальной микрофлоры элюат подвергают обработке одним из двух методов:

обработкой хлороформом или фильтрацией через стерилизующие мембраны.


5.1.6.1. При использовании хлороформа его добавляют в элюат (1 мл на 10 мл элюата),

интенсивно встряхивают 10 мин. и центрифугируют 10 мин. при 2000 об./мин. для разделения фаз.

Водную фазу (верхнюю) аккуратно отбирают пипеткой в стерильный флакон, добавляют 100 МЕ/мл

пенициллина и 10,0 мг/мл стрептомицина.


5.1.6.2. При использовании стерилизующих насадок с фильтрами 0,22 мкм элюат пробы

переносят в стерильный шприц объемом 5 - 20 мл с установленной фильтрующей насадкой и

поршнем шприца продавливают в стерильный флакон. Этот способ позволяет избежать

использования антибиотиков, токсичного хлороформа и связанных с этим мер безопасности, не

требует длительного встряхивания и центрифугирования.


5.1.7. Хранение проб.


Стерильные элюаты хранят до испытания при 4 °С не более 24 ч. При температуре -20 °С их


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


можно хранить в течение 1 года. При необходимости многократного исследования элюат делят на

несколько порций, чтобы избежать повторного замораживания.


5.2. Метод концентрирования вирусов с использованием ионообменных смол


5.2.1. Область применения.


Метод рекомендуется для концентрирования вирусов из чистых вод, воды поверхностных

водоемов и сточных вод. Объем проб для исследования определенного вида воды представлен в

табл. 1.


5.2.2. Подготовка ионообменной смолы.


Подготовку ионообменных смол (аниониты АВ-17-8, АВ-17-8-чс) осуществляют следующим

образом: сухую смолу замачивают в течение 2 - 3-х суток в дистиллированной воде. Затем воду

сливают и смолу обрабатывают смесью равных объемов свежеприготовленных растворов 2%

соляной кислоты и 10% хлорида натрия из расчета 1 л смеси на 100 г смолы. Продолжительность

контакта 24 ч. После этого смолу отмывают дистиллированной водой до нейтрального рН 7,0.


5.2.3. Концентрирования вирусов из проб воды.


Перед концентрированием рН исследуемой пробы воды доводят до значений 5,5 - 6,0 путем

добавления концентрированной соляной кислоты.


Для осуществления концентрирования стеклянную бюретку (колонку) диаметром 1,2 - 1,5 см, к

нижнему концу которой присоединен резиновый шланг с завинчивающимся зажимом,

устанавливают в штативе строго вертикально. На дно колонки помещают небольшой слой стекловаты

для удержания смолы. В колонку вносят суспензию смолы, удаляя через нижний резиновый шланг

избыток воды. Заполнение колонки следует проводить тщательно, избегая образования пузырьков

воздуха в столбике смолы. Высота столбика смолы должна быть 10 - 12 см.


Емкость с пробой воды располагают выше колонок, в нее опускают стерильный резиновый

шланг с битой пипеткой на конце. С другой стороны шланга должна быть резиновая пробка с

отверстием для прохождения воды. Через резиновый шланг с пробкой на конце воду подают в

колонку, закрывая ее пробкой. Винтовым зажимом на нижнем шланге регулируют подачу воды через

смолу, создавая скорость 10 - 12 мл в минуту.


5.2.4. Элюция вирусов с ионообменной смолы


После окончания концентрирования (примерно через 16 - 18 ч, при исследовании 10 л)

осуществляют элюцию вирусов со смолы 0,5 М раствором фосфатного буфера с рН 8,2. Для этого в

колонку вносят 10 мл фосфатного буфера, интенсивно встряхивают и оставляют в горизонтальном

положении в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем элюат переносят в стерильный флакон и

доводят до рН 7,2 1 М раствором соляной кислоты.


Приготовление 0,5 М фосфатного буфера с рН 8,2.


    Готовят  навески  солей: Na HPО  2Н О - 89,0 г  (раствор А)  и


                               2   4   2


КН РО  - 68,06 г (раствор В). Каждую  навеску  вносят в  отдельную


  2  4


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


мерную колбу,  добавляют  дистиллированную  воду  до объема  1 л и


растворяют соли. Для получения буфера с рН 8,2  смешивают  96,9 мл


раствора А и 3,1 мл раствора В и одним из этих  растворов  доводят


рН буфера до 8,2.


5.2.5. Обработка проб (см. п. 5.1.6).


5.2.6. Хранение проб (см. п. 5.1.7).


5.3. Двухэтапный метод концентрирования вирусов (сорбция на ионообменной смоле и

осаждение с помощью сульфата аммония)


5.3.1. Область применения.


Метод рекомендуется для концентрирования вируса гепатита А и энтеровирусов из проб

питьевой воды и воды водоисточников. Объем проб может колебаться от 10 до 50 л.


5.3.2. I этап. Концентрирование и элюция вируса гепатита А и энтеровирусов из проб воды при

помощи сорбции на ионообменной смоле.


В качестве сорбента используют смесь, состоящую из ионообменной смолы АВ-17-8

(подготовленной в соответствии с п. 5.2.2) и гидроксида алюминия, которой заполняют стеклянную

бюретку (колонку) диаметром 36 - 38 мм и длиной 250 - 300 мм. Колонка должна иметь в нижней

части впаянную перегородку из пористого стекла (стеклянный фильтр Шотта N 2) и резиновый

шланг, присоединенный к нижнему концу колонки. После установки колонки в штативе в нее вносят

ионообменную смолу (высота столбика смолы должна составлять не менее 30 - 40 мм) и навеску

гидроксида алюминия (8 - 10 г).


Исследуемую пробу воды в бутылях или канистре подкисляют с помощью соляной кислоты до

рН 3,0 - 4,5, располагают выше колонки и через резиновую трубку с пробкой для колонки подают

воду в колонку, регулируя скорость прохождения с помощью винта на резиновой трубке,

присоединенной к нижнему концу колонки. Скорость прохождения воды через колонку должна

составлять 10 - 15 мл/мин.


После прохождения исследуемой воды через колонку нижний резиновый шланг перекрывают и

осуществляют элюцию вируса с адсорбента при помощи 0,05 М глицинового буфера с рН 11,5,

который вносят в колонку в объеме 100 мл. Адсорбент в колонке и элюент тщательно перемешивают

и выдерживают в течение 10 - 15 мин. Затем элюат удаляют из колонки через нижний резиновый

шланг и с помощью глицинового буфера с рН 1,5 устанавливают рН элюата на уровне 7,0 - 8,0.


Приготовление глицинового буфера с рН 11,5.


Навеску 0,385 г аминоуксусной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды и

получают глицин. К 50 мл глицина добавляют 50 мл 0,1 N раствора гидроксида натрия и получают

глициновый буфер с рН 11,5.


Для приготовления глицинового буфера (рН 1,5 - 1,6) к 38 мл глицина добавляют 62 мл 0,1 N

раствора соляной кислоты.


5.3.3. II этап. Вторичное концентрирование антигена и энтеровирусов - осаждение с помощью

сульфата аммония.


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


    Вторичное  концентрирование  (осаждение)  вирусов  проводят на


холоде.  Для  этого  к  элюату  дробно  (в течение  20 - 30  мин.)


добавляют  1/2   объема   насыщенного  раствора  сульфата  аммония


((NH ) SO ),  тщательно  перемешивают  и  оставляют на ночь. Утром


    4 2  4


смесь  центрифугируют   в  течение  1 ч  при 5 - 6  тыс.  об./мин.


Супернатант   сливают,   а    осадок    растворяют   в 1  -  2  мл


физиологического раствора с рН 7,2 - 7,4.


    При  необходимости  концентрат  делят  на  2  части,  одну  из


которых исследуют  на  наличие  антигена  ВГА,  другую  подвергают


антибактериальной обработке в соответствии с п. 5.1.6 и используют


для заражения тканевых культур с целью выделения энтеровирусов.


    Приготовление насыщенного раствора сульфата аммония.


    В  1 л  теплой  стерильной дистиллированной воды  (30 - 35 °С)


растворяют 800 г сульфата аммония  ((NH ) SO ). Полученный раствор


                                       4 2  4


фильтруют, доводят до рН 7,2 и охлаждают в холодильнике.


5.3.4. Хранение проб (см. п. 5.1.7).


5.4. Метод концентрирования вирусов с использованием двухфазного разделения


Метод рекомендован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) "Рекомендации по

надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде", ВОЗ, 2003.


5.4.1. Область применения.


Метод концентрирования двухфазным разделением используют для индикации вирусов из 1 л

очищенных и неочищенных сточных вод.


5.4.2. Подготовка реактивов (для 2-х проб по 1 л).


5.4.2.1. 22% декстран (по весу) - 40 г декстрана Т 40, 142 мл стерильной дистиллированной

воды. Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели

при 4 °С.


5.4.2.2. 29% ПЭГ 6000 (по весу) - 363 г ПЭГ 6000 и 888 мл стерильной дистиллированной воды.

Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели при 4

°С. Раствор можно автоклавировать (15 мин. при 45 °С).


5.4.2.3. 150 мл (примерно) 5 М NaCl.


5.4.2.4. 1 N NaOH и 1 N HCL для установки рН.


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


5.4.3. Концентрирование пробы по 0,5 л.


5.4.3.1. Пробу центрифугируют в течение 10 мин. при 1000 g. Надосадочную жидкость

переносят из пробирок в колбу Эрленмейра емкостью 1 л, осадок хранят при 4 °С.


5.4.3.2. Доводят рН надосадочной жидкости до нейтрального уровня (7,0 - 7,5) 1 N раствором

NaOH и измеряют конечный объем надосадочной жидкости.


5.4.3.3. К 500 мл надосадочной жидкости добавляют 39,5 мл 22% раствора декстрана, 287 мл

29% раствора ПЭГ 6000 и 35 мл 5 N раствора NaCl. Тщательно перемешивают и выдерживают 1 ч

при температуре 4 °С при непрерывном встряхивании или перемешивании, используя прибор

горизонтального встряхивания или магнитную мешалку.


5.4.3.4. Для каждой пробы подготавливают стерильную коническую делительную воронку и

закрепляют ее в штативе. Смазывают скользящие поверхности кранов, но так, чтобы не закрыть в них

отверстие. Проверяют плотность кранов небольшим количеством воды. Смесь, приготовленную по

п. 5.4.3.3, переливают в воронку и оставляют на ночь при 4 °С.


5.4.3.5. Утром осторожно открывают кран воронки, медленно выпускают жидкость и собирают

нижний ее слой и промежуточную фазу в стерильную пробирку (обычно 5 - 10 мл от каждой пробы

объемом 0,5 л.).


5.4.3.6. В полученную жидкость (п. 5.4.3.5) вносят осадок (п. 5.4.3.1), добавляют хлороформ

(20% от объема образовавшейся взвеси) и встряхивают в течение 1 мин. Центрифугируют, отбирают

верхнюю водную фазу в стерильную пробирку и добавляют антибиотики (пенициллин G или

отечественный аналог и стрептомицин до конечной концентрации 100 МЕ/мл и 100 мг/мл

соответственно).


5.4.3.7. Помещают 1 мл полученного концентрата в холодильник с температурой -20 или -70 °С

для сохранения (при необходимости дальнейшего исследования). Остаток концентрата исследуют на

наличие вирусов на культурах тканей, РНК-методом ОТ-ПЦР и антигена - методом ИФА.


5.5. Метод концентрирования вирусов с помощью флизелиновых пакетов с макропористым

стеклом


5.5.1. Область применения.


Метод (качественный) используют для концентрирования вирусов из воды поверхностных

водоемов, сточной воды. Время концентрирования вирусов должно составлять 3 - 7 суток.


5.5.2. Подготовка макропористого стекла (МПС) <*>.


--------------------------------


<*> Можно использовать готовые стандартные наборы, разрешенные к применению в

Российской Федерации в установленном законодательством порядке.


    Для  повышения  сорбционных  свойств   макропористого  стекла,


представляющего  собой  белый  порошок, его обрабатывают следующим


образом: один  объем  стекла  заливают в колбе одним объемом смеси


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


(1:1) 3%  раствора  Н О  и  6 М раствора  HCl и кипятят в вытяжном


                     2 2


шкафу в течение 1 ч без  пробки,  соблюдая  меры предосторожности.


Отмывают большим количеством дистиллированной воды до нейтрального


значения рН и высушивают при 100 °С.


В пакет из флизелина размером 5 х 7 см помещают 3,0 см подготовленного сорбента.


5.5.3. Концентрирование вирусов.


Пакет с сорбентом закрепляют с помощью лески за неподвижный предмет так, чтобы он

оказался в токе воды. После экспозиции в течение 3 - 7 суток пакет вынимают, помещают в

отдельный новый полиэтиленовый мешочек или стерильный флакон и доставляют в лабораторию в

сумке-холодильнике в максимально короткий срок (не более 6 ч). Каждую пробу маркируют с

указанием точки отбора, датой установки и времени экспозиции пакета. До обработки пробы можно

хранить не более суток при 4 °С.


5.5.4. Элюция вирусов с МПС.


Пакет с сорбентом извлекают из транспортировочной емкости и помещают в стерильную чашку

Петри. Обрезают край пакета, вымывают стекло дистиллированной водой (5 мл) с помощью пипетки

в эту же чашку Петри и переносят пипеткой или через воронку в колонку объемом 5 - 10 мл. Вирусы

элюируют ступенчато тремя растворами по 3 мл каждый, собирая фракции в отдельные

пенициллиновые флаконы. Исследованию подвергают каждую фракцию в отдельности (всего 3

фракции). В качестве элюирующих растворов используют: 1) 0,05 М трис-НС1 рН 9,1; 2) 0,05 М трис-

HCl рН 9,1 и 0,5 М NaCl; 3) 3% мясной экстракт на 0,05 М трис-HCl рН 9,1.


5.5.5. Обработка проб (см. п. 5.1.6).


5.5.6. Хранение проб (см. п. 5.1.7).


5.6. Метод концентрирования вирусов с использованием набора для сбора и концентрирования

вирусов из питьевой воды с помощью ловушечного устройства.


Ловушечное устройство состоит из насадки на водопроводный кран, к которой с помощью

синтетической трубки прикреплен держатель. В держатель, состоящий из двух свинчивающихся

частей с резьбой, вставляется специальная ловушка, внутри которой находится адсорбент,

сорбирующий вирусы из воды. Применяемая ловушка является одноразовой, а само устройство

может использоваться после стерилизации многократно в соответствии с прилагаемой инструкцией.


5.6.1. Область применения.


Метод используют для концентрирования вирусов из водопроводной воды.


5.6.2. Подготовка ловушечного устройства и фильтрование воды.


Перед использованием в ловушечное устройство вставляют ловушку, после чего его

заворачивают в бумагу для стерилизации и стерилизуют сухим жаром при температуре 80 °С 45 мин.

Ловушечное устройство с вставленной ловушкой доставляют на место отбора в стерильной упаковке.

После трехкратного обжигания водопроводного крана и спуска воды в течение 15 мин.

устанавливают необходимую скорость ее протекания - 1 л за ~ 1,5 мин., что составляет 40 - 45 л/ч.


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


Ловушечное устройство извлекают из стерильной упаковки и устанавливают его на кран. Объем

пропускаемой воды должен составить 1000 л, что достигается при скорости тока воды 40 - 45 л/ч в

течение 24 ч. Спустя 24 ч ловушечное устройство снимают с крана и помещают в стерильный пакет,

который доставляют в вирусологическую лабораторию. После извлечения ловушки использованное

ловушечное устройство подвергают обеззараживанию в 3% растворе перекиси водорода в течение 12

ч, затем многократно (не менее 10 раз) промывают в проточной воде и высушивают для

последующей стерилизации и повторного использования.


5.6.3. Элюция сконцентрированных вирусных частиц.


Ловушку с адсорбентом в стерильных условиях извлекают из ловушечного устройства и

помещают в чашку Петри. С помощью ножниц ловушку вскрывают, содержащийся внутри адсорбент

вымывают в чашку Петри стерильной дистиллированной водой в объеме 5 - 10 мл. Полученную

взвесь адсорбента в дистиллированной воде переносят с помощью пипетки с отпиленным концом в

стеклянную колонку. Вытекающую из колонки воду собирают в стерильный пенициллиновый

флакон. Элюцию вирусов осуществляют с помощью специального элюента, содержащегося в наборе.

Для получения рабочего раствора концентрат разводят стерильной дистиллированной водой в

соотношении 1:10 (объем элюента/объем воды). Вирус элюируют путем пропускания 3 мл элюента

через адсорбент в колонке. Полученную фракцию (элюат) собирают в стерильный пенициллиновый

флакон.


Использованный адсорбент заливают 3% раствором перекиси водорода для обеззараживания на

12 ч.


С целью увеличения эффективности обнаружения вирусов в элюатах проб воды при

исследовании методом ПЦР (обнаружение РНК энтеровирусов) и ИФА (обнаружение антигенов

энтеровирусов) проводят дополнительное концентрирование элюатов с помощью

ультрацентрифугирования либо обрабатывают элюаты полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ 6000).


5.6.3.1. Ультрацентрифугирование элюата.


Ультрацентрифугирование проводят при 40000 - 50000 g в течение 2 ч с использованием

угловых или бакет-роторов. В стерильную центрифужную пробирку наливают вируссодержащий

элюат, а затем с помощью шприца на дно пробирки наслаивают 10 - 20% раствор сахарозы так, чтобы

она занимала 5 - 10% от объема пробирки. После центрифугирования супернатант удаляют. Осадок

ресуспендируют в 0,5 мл стерильной дистиллированной воды для ПЦР-исследований или в

фосфатно-солевом твинсодержащем буфере (рН 7,2) для ИФА.


5.6.3.2. Обработка элюата полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ 6000).


В элюат добавляют ПЭГ 6000 и хлористый натрий, находящийся непосредственно в пробирках

для центрифугирования, до конечных концентраций 10% и 0,5 М соответственно. Смесь тщательно

перемешивают до растворения ПЭГ и затем выдерживают в течение 10 - 12 ч при 4 °С.

Образовавшуюся суспензию центрифугируют при 10000 g в течение 1 ч или при 6000 g в течение 2 ч.

Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 0,5 мл стерильной дистиллированной воды для

ПЦР-исследований или в фосфатно-солевом твинсодержащем буфере (рН 7) - для ИФА.


5.6.4. Обработка проб (п. 5.1.6).


5.6.5. Хранение проб (п. 5.1.7).

1   2   3   4

Похожие:

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. N 3)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Микроб"; фгуз "Причерноморская противочумная станция"; Управлением Роспотребнадзора по г
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Методические указания предназначены для использования специалистами организаций
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Российской медицинской академией последипломного образования; фгун санкт-Петербургский
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconПисьмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и Федеральной службы по контролю за оборотом наркотиков
См также письмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и Федеральной службы по экономическим...
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconФедеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Территориальное управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому...
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconА. Е. Жерихов «26» января 2006 г
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Разместите кнопку на своём сайте:
kaz.docdat.com


База данных защищена авторским правом ©kaz.docdat.com 2013
обратиться к администрации
kaz.docdat.com
Главная страница