Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный




НазваниеУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
страница3/4
Дата конвертации01.03.2016
Размер0.69 Mb.
ТипДокументы
1   2   3   4

6. Методы выделения энтеровирусов в культурах клеток


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


Исследование полученных элюатов на энтеровирусы проводят в культуре ткани в соответствии

с документом "Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита", рекомендованным

Всемирной организацией здравоохранения (1998). При этом следует отметить, что для выделения

вирусов используют максимально возможный полученный элюат (кроме 1 мл, заложенного на

хранение, и объема, используемого для исследования в ИФА и ПЦР). Для выделения вирусов

используют следующие культуры тканей: RD, Hep-2, BGM и другие чувствительные к энтеровирусам

линии клеток.


Перевиваемые культуры клеток RD, Hep-2 (Cincinnatti), BGM наиболее пригодны для проведения

лабораторных исследований и позволяют выделять достаточно широкий спектр энтеровирусов,

которые могут присутствовать в водных объектах окружающей среды.


Культура клеток RD, происходящая из человеческой рабдомиосаркомы, обладает высокой

чувствительностью к вирусам полиомиелита, многим типам вируса ECHO, некоторым вирусам

Коксаки А. Вирусы полиомиелита и вирусы Коксаки В хорошо размножаются в культуре клеток Нер-

2, полученной из эпидермоидной карциномы человека. Культура клеток BGM - перевиваемая

культура клеток почек африканской зеленой мартышки - чувствительна к вирусам полиомиелита и

вирусам Коксаки В. Использование, по крайней мере, двух культур позволяет выявлять, возможно,

больший спектр вирусов, а комбинация клеток, обладающих различной чувствительностью к

различным энтеровирусам, может помочь при идентификации выделенного цитопатогенного агента.

Чрезвычайно полезным является поддержание и использование в лабораторных исследованиях

культуры клеток L20B. Эта культура клеток создана на основе мышиной линии L-клеток, в которую

экспрессированы человеческие рецепторы к полиовирусу. Она позволяет селективно выделять

только полиовирусы, что делает ее незаменимой культурой при идентификации выделенных

цитопатогенных агентов для разделения смесей вирусов. Чувствительность культур клеток к

различным энтеровирусам представлена в табл. 2.


Таблица 2


ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК К РАЗЛИЧНЫМ


ЭНТЕРОВИРУСАМ


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


Вирусы       Проявление цитопатогенного эффекта    

на культуре клеток            

RD      Нер-2 BGM L20B     

Полиомиелита 1 - 3  +           +      +    +              

ECHO                +           -      +/- + -              

Коксаки А           +/-, за     -      -    +/- (Коксаки А 

исключением 2 - 6, 8, 10,  

А1, А19, А22 14)            

Коксаки В           -           +      +    -              

Энтеровирусы 68 - 71 +/-         -      -    -              

+ - наличие цитопатогенного эффекта;                           

- - отсутствие его;                                            

+/- - может быть.                                              


Культуры клеток для лабораторного исследования следует получать из аттестованного

источника, например, из лаборатории, обладающей банком клеток. Необходимо периодически

контролировать чувствительность используемых в лаборатории клеток. Для этого после каждых 8 -

10 пассажей клеток на них проводят титрование референс-штаммов вакцинного вируса

полиомиелита. После 15 - 20 последовательных пассажей следует перейти на свежую линию из

банка клеточных культур или получить ее в референс-лаборатории. Эта процедура позволяет

сохранять высокую чувствительность клеток и снижает риск контаминации клеток микоплазмами.


    Для исследования одной пробы используют не менее двух  культур


клеток  площадью  не  менее  75  кв.  см.  Это  соответствует трем


флаконам емкостью 50,0 мл  (поверхность каждого флакона составляет


25 кв. см).  Два из этих флаконов  должны быть с культурой  клеток


RD, один - с любой другой из рекомендованных культур.  Флаконы  со


свежеобразованным монослоем клеток микроскопируют  для того, чтобы


убедиться в здоровом состоянии клеток. Монослой клеток, подходящий


для заражения,  обычно  формируется  в  течение  2 - 3 дней  после


                                                              6


"посадки"  клеток  на  флаконы при  концентрации клеток 1 х 10  мл


ростовой   среды.   После   замены   ростовой   среды  на  4,5  мл


поддерживающей среды  (без сыворотки) флаконы маркируют (указывают


номер пробы,  дату  заражения,  номер  пассажа).  В  каждый флакон


вносят  по  0,5  мл   обработанной  исследуемой  пробы  воды.  Все


используемые клеточные линии  следует  инокулировать одновременно.


Обязательно  оставляют  по  1 незараженному  контрольному  флакону


каждой   культуры.   Флаконы    инкубируют    в    термостате  при


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


температуре   36 °С.  Ежедневно,  обычно  в  течение  5 - 7  дней,


проверяют культуры  на  наличие цитопатогенного эффекта (ЦПЭ). Все


признаки     ЦПЭ,    токсичности,     контаминации    посторонними


микроорганизмами   регистрируют   в   лабораторном   журнале.  При


появлении ЦПЭ  (при  охвате  изменениями  75% клеточного монослоя)


прекращают инкубацию  флаконов  и сохраняют культуральную жидкость


при 20 °С для  следующего  пассажа  на  той  же  культуре  клеток.


Содержимое    каждого   флакона   с   культурой  клеток  пассируют


индивидуально,  флаконы  никогда не  объединяют. Для пассажа могут


быть использованы  культуры,  выращенные  в  пробирках.  Если  при


первичном заражении не наблюдали  ЦПЭ,  то  делают  так называемый


"слепой" пассаж. Культуры, в которых не проявлялся ЦПЭ, инкубируют


и наблюдают в течение  не  менее  14 дней.  При  отсутствии  ЦПЭ в


течение этого срока культуры отбрасывают как негативные.


При хорошем состоянии культуры клеток первичное заражение и один пассаж вместе

составляют период наблюдения 14 дней. В ряде случаев (например, при выделении агента с низкой

цитопатогенной активностью, или при наличии в пробе вируса в небольшом количестве)

необходимо сделать последующие пассажи. При этом следует помнить, что каждый последующий

пассаж увеличивает риск перекрестной контаминации.


При выделении вирусов из проб воды различного происхождения в культуре клеток можно

столкнуться с рядом нежелательных явлений. Если при первичном заражении в культуре клеток

развивается быстрая (в течение 1 - 2 дней после внесения исследуемого субстрата) дегенерация

клеток, то, скорее всего, это связано с неспецифической токсичностью пробы. Такие культуры нужно

заморозить при -20 °С, оттаять и выполнить пассаж. Если признаки токсичности обнаружатся вновь,

то следует вернуться к исходной пробе, развести ее ФСБ 1:10 и повторить заражение. Бактериальная

контаминация, которая проявляется в виде помутнения среды, приводит к гибели клеток и делает

выявление вирусного ЦПЭ затруднительным или невозможным. В этом случае следует вернуться к

исходной пробе, обработать ее хлороформом и повторить процедуры заражения.


Особое внимание следует уделять предупреждению перекрестной вирусной контаминации во

время процедур заражения и пассирования. Нельзя сливать среду через край флакона или пробирки, в

которые вносилась исследуемая проба, даже если ЦПЭ отсутствует. Удаление среды производят

пипеткой, которую меняют после каждой процедуры. При заражении с помощью автоматических

микропипеток используют только наконечники с фильтрами. Следует избегать процедур, при

которых образуются аэрозоли (например, энергичное пипетирование); по возможности не

рекомендуется использование посуды с резиновыми пробками, которые помещаются внутрь

горлышка флакона или пробирки, целесообразно использовать посуду с внешней резьбой на

горлышке, которая закрывается завинчивающимися крышками.


Известно, что в пробах воды присутствуют смеси вирусов, с чем могут быть связаны

затруднения при идентификации выделенных изолятов. Для разделения смесей и правильной

идентификации выделенных вирусов, а также для того, чтобы избежать потери вирусов


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


полиомиелита, все изоляты, "положительные" на культуре клеток RD, следует пассировать на клетки

L20B. Наличие выраженного ЦПЭ указывает на присутствие в пробе вируса полиомиелита.

Некоторые реовирусы, аденовирусы, а также неполио-энтеровирусы могут проявлять ЦПЭ на клетках

L20B и затруднять идентификацию выделенных изолятов и интерпретацию результатов

исследования. Такие изоляты следует направить в соответствующую референс-лабораторию для

заключительного исследования.


В лабораторной практике часто используют метод адсорбции исследуемого материала на

клеточном монослое. При использовании этого метода из флакона/пробирки удаляют ростовую среду,

ополаскивают монослой стерильным ФСБ, вносят исследуемую пробу и инкубируют флакон при

температуре 36 °С в течение 1 ч. Таким образом, создают лучшие условия для адсорбции вируса

клетками, если он присутствует в пробе. После истечения срока инкубации в каждый

флакон/пробирку вносят необходимое количество поддерживающей среды. Применение этого метода

может способствовать выявлению вируса при его незначительных количествах в исследуемом

материале, а также ускорить проявление ЦПЭ, по крайней мере, на 1 сутки. Следует иметь ввиду, что

при использовании этого метода, в результате дополнительных открываний крышек, во много раз

возрастает вероятность контаминации (перекрестной вирусной или бактериальной). Его

рекомендуется проводить в ламинарном шкафу. Ввиду высокого риска контаминации этот метод не

следует использовать для пассирования или инокуляции изолятов вирусов.


7. Идентификация цитопатических агентов, выделенных


в реакции нейтрализации


    В основе идентификации выделенных цитопатических агентов (ЦПА)


в реакции нейтрализации лежит взаимодействие исследуемого вируса с


гомологичной антисывороткой (или  смесью  антисывороток),  которая


нейтрализует вирус,  что  проявляется  в  виде  отсутствия  ЦПЭ на


культуре клеток. Обычно в опыте  нейтрализации вирусную суспензию,


содержащую 100 ТЦД  ,  смешивают с  диагностическими  сыворотками.


                  50


После инкубации в течение 1 - 2 ч при 37 °С  эту смесь соединяют с


культурой клеток. Опыт ежедневно просматривают под  микроскопом  в


течение не менее 3 дней. Иммунная сыворотка, которая предотвращает


развитие ЦПЭ, указывает тип вируса.


    При  постановке  реакции  нейтрализации  необходимо  соблюдать


несколько важнейших положений.


    Для идентификации ЦПА всегда используют  ту  культуру  клеток,


на которой они были выделены. Если ЦПА был  выделен  в  нескольких


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


культурах  клеток,  то  следует  провести  идентификацию   каждого


штамма. Это связано с тем, что в  пробах  воды  могут  содержаться


смеси  энтеровирусов,  а  чувствительность  клеточных  культур   к


различным энтеровирусам различна.


    В  опыте   необходимо   использовать  разведение   испытуемого


изолята,   содержащее   100 ТЦД  .  Для   того   чтобы  определить


                               50


необходимое   разведение,   проводят   предварительное  титрование


выделенного ЦПА. Опытные лаборатории, использующие культуры клеток


со стабильной чувствительностью, могут  избежать  этой  процедуры.


Известно,  что  суспензия  вируса,  полученная  на  культуре,  где


цитопатогенные  изменения поражают  75 - 100% клеточного монослоя,


                    6


содержит примерно 10  ТЦД  . Поэтому в опыте используют разведения


  -3     -4              50


10   и 10  .  Это  экономит  время   исследования   и   материалы,


необходимые для  предварительного  титрования.  Однако контрольное


титрование исследуемого  изолята  рекомендуется  включать в каждый


опыт по идентификации.  Это  позволяет  рассчитать  титр  вируса в


условиях данного опыта.


Реакцию нейтрализации проводят в панелях для культуры клеток с плоским дном (микрометод).

Микрометод позволяет экономить все компоненты, необходимые для постановки опыта, однако при

недостаточном опыте возникает опасность перекрестной лабораторной контаминации.


Титрование вирусов, а также постановку реакции нейтрализации выполняют в соответствии с

документом "Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита".


8. Выявление РНК кишечных вирусов (вируса гепатита А,


ротавирусов, энтеровирусов) методом полимеразной цепной


реакции с этапом обратной транскрипции


Организация и постановка полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции

(ОТ-ПЦР) для выявления РНК энтеровирусов, ротавирусов и вируса гепатита А из концентратов

проб воды поверхностных, подземных источников, питьевой и сточных вод может быть


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


осуществлена в лабораториях, оснащенных необходимым оборудованием.


8.1. Меры предосторожности и правила работы при постановке полимеразной цепной реакции

с этапом обратной транскрипции


Организацию работы в ПЦР-лаборатории осуществляют в соответствии с документом

"Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих

метод полимеразной цепной реакции", утв. Государственным комитетом санитарно-

эпидемиологического надзора Российской Федерации 22 июня 1995 года.


8.1.1. Лабораторию разделяют на зоны (комнаты) для каждой из стадий ПЦР-диагностики.


Следует иметь не менее двух комнат:


- пре-ПЦР-помещение, где проводят обработку образцов из объектов окружающей среды

(элюаты), выделение нуклеиновых кислот, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановку

ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном

отдельном помещении). В этих помещениях не допускается проводить все другие виды работ с

инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты и т.д.),

ПЦР-диагностику которых проводят в данной лаборатории;


- пост-ПЦР-помещение, где проводят детекцию продуктов амплицификации. В пост-ПЦР-

помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых

проводится в данной лаборатории.


8.1.2. Помещение для детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) располагают

как можно дальше от пре-ПЦР-помещений,


8.1.3. Работу в лаборатории организовывают в одном направлении: от пре-ПЦР-помещений к

пост-ПЦР-помещению.


8.1.4. При исследовании материала, зараженного или подозрительного на зараженность

возбудителями инфекционных заболеваний I - IV групп, работу проводят в соответствии с

нормативно-методическими документами.


8.1.5. Используют одноразовую пластиковую посуду.


8.1.6. Работают в одноразовых перчатках.


8.1.7. Перчатки и халаты меняют при переходе из одной зоны в другую.


8.1.8. Поверхности столов, а также помещения, в которых проводят постановку ПЦР, до начала

и после окончания работ обеззараживают ультрафиолетовым излучением.


8.1.9. Для работы в ПЦР-лаборатории допускается персонал, прошедший специальную

подготовку.


8.2. Меры предосторожности и правила работы при постановке электрофореза


Реагент бромистый этидий является сильным мутагеном, поэтому все манипуляции проводят с

использованием перчаток. Все реагенты, содержащие бромистый этидий, перед утилизацией

подвергают специальной обработке.


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


Отработанные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую емкость на 5 л с плотно

завинчивающейся крышкой. Добавляют 1 объем 0,5 М раствора калия перманганата и один объем 2,5

М соляной кислоты. Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 4 - 6 ч.

Добавляют один объем 2,5 М натрия гидроксида, аккуратно перемешивают. Сбрасывают

нейтрализованные реактивы в канализацию.


8.3. Контроль полимеразной цепной реакции


Положительный (ПКО) и отрицательный (ОКО) контрольные образцы используют для

контроля специфичности ПЦР. В качестве ПКО используют любой штамм энтеровирусов,

ротавирусов и вируса гепатита А для выявления соответствующих возбудителей. В качестве ОКО

используют стерильную воду, не содержащую вирусной РНК.


8.4. Выявление РНК ротавирусов и вируса гепатита А


Метод ОТ-ПЦР используют для выявления РНК вирусных агентов в исследуемых пробах воды.

Исследованию подлежат элюаты проб питьевой воды, воды подземных водоисточников, речной и

сточных вод. Для выделения РНК из концентратов проб питьевой воды и воды подземных

водоисточников применяют метод афинной сорбции РНК на частицах силикагеля в соответствии с

документом "Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях,

использующих метод полимеразной цепной реакции", утв. Госкомсанэпиднадзором 22 июня 1995

года (для выделения РНК рекомендуется использовать готовые комплекты, например, типа

"Амплисенс" и др.).


Для выделения РНК из концентратов проб воды поверхностных водоисточников и сточных вод

необходимо применять метод двустадийного выделения <*>:


- фенол-хлороформная экстракция;


- сорбция РНК на частицы силикагеля.


--------------------------------


<*> Проводят в соответствии с методическими указаниями МУ 1.3.1888-04 "Организация

работы при исследовании методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими

агентами 3 - 4 группы патогенности".


8.5. Постановка реакции обратной транскрипции, проведение полимеразной цепной реакции и

электрофоретический анализ продуктов полимеразной цепной реакции с этапом обратной

транскрипции-амплификации (ОТ-ПЦР-амплификации)


Рекомендуется использовать ПЦР-тест-системы на вирус гепатита А и ротавирусы с

электрофорезом в агарозном геле (кат. N V4-50-R0,5; V4-50-R0,2; V15-50-R0,5; 15-50-R0,2),

разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном

законодательством порядке.


8.6. Обнаружение энтеровирусов методом полимеразной цепной реакции с этапом обратной

транскрипции (ОТ-ПЦР) с использованием культуры ткани для выявления репликативной "минус"


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


нити РНК энтеровирусов


Для подтверждения инфекционности выделенных энтеровирусов проводят первичное

заражение элюатом культуры клеток, через двое суток после культивирования зараженных клеток

проводят ОТ-ПЦР с культуральной жидкостью при наличии ЦПД или с лизатом клеток культур

тканей при отсутствии ЦПД. Суть методики состоит в выявлении с помощью ПЦР негативной минус

цепи ("-" цепи) РНК энтеровирусов после их культивирования в культуре ткани. Негативная цепь

является промежуточным продуктом репликации вируса, и ее обнаружение служит косвенным

доказательством потенциальной инфекционности вируса.


8.6.1. Заражение культур клеток и их последующая обработка.


    Для  проведения  ОТ-ПЦР  следует  использовать  не менее  двух


культур  клеток,  учитывая  их чувствительность  к различным типам


энтеровирусов.   Рекомендуется  использовать  следующие  сочетания


клеточных  культур:  BGM  и  Нер-2  или  Нер-2 и RD.  В  пробирках


(пенициллиновых   флаконах)   с  хорошо  сформированным  клеточным


монослоем  заменяют  ростовую  среду  на  поддерживающую  с 1 - 2%


сыворотки  крови  эмбрионов  крупного рогатого скота и добавлением


антибиотиков:  пенициллина  в дозе до 1000 МЕ/мл и стрептомицина в


дозе  до  200 мкг/мл.  При культивировании клеток в инкубаторе без


содержания СО , рекомендуется для стабилизации рН  в синтетические


             2


среды добавлять Hepes (25 мМ).


Маркируют пробирки (по 2 на каждую исследуемую пробу), вносят в каждую по 0,1 мл элюата и

помещают в термостат (36,5 - 37,0 °С). Для контроля оставляют по несколько пробирок с

незараженной культурой (со сменой и без смены среды).


Инкубируют зараженные клетки в течение 5 суток, микроскопируя их ежедневно для контроля

начала цитопатического действия. При первых признаках деградации культуры (но не позднее 5-х

суток) пробирки извлекают из термостата, удаляют из них культуральную среду и промывают

физраствором (или раствором Хенкса). После промывки тщательно (пипеткой) удаляют из пробирок

остатки промывной жидкости.


Перед началом процедуры выделения РНК пробирки с культурой ткани, освобожденной от

промывной жидкости, трижды подвергают замораживанию при -20 °С и размораживанию при 37

°С, что обеспечивает выход энтеровирусов из клеток культуры, после чего переходят к выделению

РНК.


8.6.2. Выделение РНК.


Выделение РНК можно осуществлять с использованием стандартных наборов в соответствии с

инструкцией производителя, например, типа "Рибозоль", "Рибосорб" и др. РНК можно хранить в

течение 1 месяца в изопропаноле при -20 °С. Для длительного хранения к раствору РНК добавляют

два объема 70% этанола и помещают для хранения в морозильную камеру (при -70 °С).


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


8.6.3. Обратная транскрипция.


8.6.3.1. Праймерные последовательности.


Праймерные последовательности можно синтезировать под заказ в организациях-

производителях. Для постановки ИКК-ПЦР необходимо специально синтезировать 1

энтеровирусспецифический праймер, используемый на стадии обратной транскрипции

(последовательность указана в табл. 3).


Таблица 3


На каком этапе  Название  Последовательность     

используется  

Обратная транс-   НП1 (прямой) 5'-CGCCTGTTTTATACCCCCTCCCCCAA-

крипция           3'


Праймеры, необходимые для проведения ПЦР, входят в состав готовой стандартной тест-

системы.


8.6.3.2. Расчет рабочих концентраций праймеров.


Поставку праймеров производителем осуществляют в количествах, измеряющихся в оптических

единицах (ОЕ) на мл. Для расчета рабочих концентраций праймеров необходимо перевести ОЕ в

мкМ. Для праймера длиной А пар нуклеотидов (п.н.), поставляемом в количестве В ОЕ, пересчет

осуществляют следующим образом:


- определяют молекулярную массу (ММ) одноцепочечной ДНК (оцДНК) по формуле:

1   2   3   4

Похожие:

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. N 3)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Микроб"; фгуз "Причерноморская противочумная станция"; Управлением Роспотребнадзора по г
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Методические указания предназначены для использования специалистами организаций
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Российской медицинской академией последипломного образования; фгун санкт-Петербургский
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconПисьмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и Федеральной службы по контролю за оборотом наркотиков
См также письмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и Федеральной службы по экономическим...
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconФедеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Территориальное управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому...
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconА. Е. Жерихов «26» января 2006 г
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Разместите кнопку на своём сайте:
kaz.docdat.com


База данных защищена авторским правом ©kaz.docdat.com 2013
обратиться к администрации
kaz.docdat.com
Главная страница