Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный




НазваниеУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
страница4/4
Дата конвертации01.03.2016
Размер0.69 Mb.
ТипДокументы
1   2   3   4

ММ = 330 дальтон (ММ 1 п.н.) х А;


- определяют концентрацию праймера, исходя из того, что 1 ОЕ оцДНК соответствует

концентрации 37 мкг/мл, соответственно В ОЕ соответствуют концентрации 37 х В мкг/мл;


- определяют концентрацию праймера С в мкМ:


С = (37 х В х 1000) / (330 х А) (мкМ).


Ряд организаций - производителей обратной транскриптазы в инструкциях по постановке

реакции обратной транскрипции указывают не концентрацию праймеров в мкМ, а количество

праймера, добавляемое в реакцию (в pmol). В этом случае пересчет ОЕ в pmol следует производить по

формуле:


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


D = B / (0,01 х А),


где D - количество праймера (в pmol), содержащееся в 1 мкл раствора.


8.6.3.3. Постановка реакции обратной транскрипции.


Для обратной транскрипции можно использовать готовые стандартные наборы реагентов,

разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке. В

состав наборов входят буферный раствор и фермент - обратная транскриптаза (ревертаза) различного

происхождения. Ингибитор РНКаз и смесь ДНТФ некоторые производители поставляют отдельно.

Все компоненты реакционной смеси для обратной транскрипции можно приобретать по

отдельности.


Постановка:


- в 0,2 мл (или 0,5 мл) пробирки вносят: 10,0 - 14,5 мкл РНК пробы, 10 - 20 pmol прямого

праймера НП1;


- смесь аккуратно перемешивают, осаждают центрифугированием (5 с при 5000 об./мин. или с

использованием вортекса) и помещают в термоциклер на 70 °С 10 мин.;


- по истечении времени нагревания пробирки достают и помещают на лед;


- в пробы добавляют: 5х или 10х буфер для обратной транскрипции (конечная концентрация -

1х), 1 мкл ДНТФ (100 - 200 мкМ), обратную транскриптазу (100 - 200 ед.), ингибитор РНКаз (20 ед.).

Общий объем реакционной смеси составляет 20 мкл. Объем реакционной смеси при необходимости

доводят с помощью свободной от РНКаз воды;


- смесь перемешивают, осаждают центрифугированием и выдерживают при комнатной

температуре 10 - 15 мин.;


- пробирки помещают в термоциклер и выдерживают 50 мин. при 37 - 42 °С (время и

температуру, необходимые для работы фермента, указывают в инструкции производителя).


После синтеза кДНК на РНК матрице пробы используют для ПЦР-амплификации.


8.6.3.4. Полимеразная цепная реакция.


Амплификацию полученной в реакции обратной транскрипции кДНК осуществляют с

использованием тест-системы для амплификации участка кДНК энтеровирусов длиной 207 п.н. (кат.

N V-16-100-R0,5 или кат. N V-16-100-R0,2) в соответствии с прилагаемой инструкцией.


8.6.4. Анализ амплифицированной ДНК, учет результатов.


Для анализа амплифицированной ДНК используют разные методы, наиболее простым из

которых является гель-электрофорез. Для постановки электрофореза можно использовать комплект

стандартных реагентов для электрофореза в агарозном геле (кат. N К5-200) в соответствии с

инструкцией производителя.


Учет результатов проводят визуально с помощью трансиллюминатора. При этом агарозный гель

либо достают из кюветы и помещают на стекло трансиллюминатора, либо используют емкости из

УФ-проницаемых материалов.


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


При постановке ОТ-ПЦР для выявления в пробе "минус" цепи РНК энтеровирусов,

положительные образцы должны содержать полосу ДНК размером 207 п.н. Размер полосы

определяют по соотношению с положительным контролем и ДНК-маркером. Результаты можно

документировать посредством фотографирования или видеосъемки геля с использованием

ультрафиолетовых фильтров.


8.6.5. Интерпретация результатов, полученных с использованием культур тканей методом ОТ-

ПЦР.


Выявление негативной РНК ("минус" цепи РНК) энтеровирусов в пробе исследуемой воды с

помощью ОТ-ПЦР зараженных культур клеток свидетельствует о присутствии в ней инфекционных

энтеровирусов и интерпретируется как положительный результат молекулярного теста на

инфекционность энтеровирусов.


9. Определение вирусных антигенов ротавирусов и вирусного


гепатита А в иммуноферментном анализе


Элюаты, полученные после концентрирования исследуемых объемов воды, анализируют

методом иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к

готовому стандартному диагностическому набору.


10. Библиографические данные


1. Закон Российской Федерации от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом

благополучии населения".


2. Закон Российской Федерации от 19 декабря 1991 г. N 96-ФЗ "Об охране окружающей среды".


3. Водный кодекс Российской Федерации от 16 ноября 1995 г. N 167-ФЗ.


4. "Положение о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и

благополучия человека", утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 30

июня 2004 г. N 322.


5. СанПиН 2.1.5.980-00 "Гигиенические требования к охране поверхностных вод".


6. СанПиН 2.1.4.1074-01 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды

централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества".


7. СанПиН 2.1.4.1116-02 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды,

расфасованной в емкости. Контроль качества".


8. СанПиН 2.1.4.1175-02 "Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного

водоснабжения. Санитарная охрана источников".


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


9. СанПиН 2.1.2.1188-03 "Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству,

эксплуатации и качеству воды. Контроль качества".


10. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности

(опасности)".


11. МУ 2.1.5.800-99 "Организация госсанэпиднадзора за обеззараживанием сточных вод".


12. "Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях,

использующих метод полимеразной цепной реакции", утверждены Государственным комитетом

санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации 22 июня 1995 года.


13. МУ 1.3.1888-04 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала,

инфицированного патогенными биологическими агентами III - IV групп патогенности".


14. "Положение о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий,

вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического

происхождения". М., 1980.


15. ГОСТ 2761-84 "Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения".


16. Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита. М., 1998.


17. Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. Женева, 2003.


18. Инструкция по использованию полимеразной цепной реакции для выявления

энтеровирусного загрязнения воды. Минск, 2001.


19. Методики по санитарно-вирусологическому контролю питьевой воды и оценке ее

эпидемической безопасности от 18.05.99 N 136-9811, Минск.


20. Инструкция по осуществлению санитарно-вирусологического мониторинга питьевых вод в

Республике Беларусь от 11.11.00 N 138-0010, Минск.


21. Boom R., C.J.A. Sol, M.M. Salimans, C.L. Jansen, P.M.E. Wertheimvan Dillen, and J. Van der

Noordaa. 1990. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. J. Clin. Microbiol. 28:495-503.


22. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Eds. J. Sambrook, P. MacCallum D. Russell. CSHL Press,

London: 2001, 2344 p.


Список сокращений


БОЕ - бляшкообразующая единица;


ВГА - вирус гепатита А;


ВГА Аг - антиген вируса гепатита А;


ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения;


ИФА - иммуноферментный анализ;


МПС - макропористое стекло;


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.


ОКВИ - острые кишечные вирусные инфекции;


ПЦР - полимеразная цепная реакция;


ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с этапом обратной транскрипции;


ПЭГ - полиэтиленгликоль;


РН - реакция нейтрализации;


РНК - рибонуклеиновая кислота;


РВ - ротавирусы;


Рота Аг - ротавирусные антигены;


ТЦД 50/мл - тканевая цитопатическая доза вируса, вызывающая ЦПЭ в 50% зараженных

клеточных культур;


ЦПА - цитопатический агент;


ЦПЭ - цитопатический эффект;


ч.д.а. - чистый для анализа;


BGM - перевиваемые клетки почки африканской зеленой мартышки;


Нер-2 - перевиваемые клетки карциномы гортани человека;


RD - перевиваемые клетки рабдомиосаркомы человека;


L20B - перевиваемая мышиная линия L-клеток, в которую экспрессированы человеческие

рецепторы к полиовирусу.


Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
1   2   3   4

Похожие:

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. N 3)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Микроб"; фгуз "Причерноморская противочумная станция"; Управлением Роспотребнадзора по г
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Методические указания предназначены для использования специалистами организаций
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconУтверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный
Российской медицинской академией последипломного образования; фгун санкт-Петербургский
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconПисьмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и Федеральной службы по контролю за оборотом наркотиков
См также письмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и Федеральной службы по экономическим...
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconФедеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Территориальное управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому...
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный iconА. Е. Жерихов «26» января 2006 г
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Разместите кнопку на своём сайте:
kaz.docdat.com


База данных защищена авторским правом ©kaz.docdat.com 2013
обратиться к администрации
kaz.docdat.com
Главная страница